武汉核成科技发展有限公司—显微成像、分子成像、活体成像
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如何选购显微成像摄像系统?
点击次数: 发布时间:【2018-04-08】

    如今,图像处理技术在大范围的光学显微应用中使用,其中包括医学和生物学研究、诊断、医疗产品测试或材料科学。 有了显微镜,即可直接访问并研究最多样化的对象的结构和功能。然而,仅使用一个方法,基本上不太可能得到所需的所有信息。 因此,提供众多显示方案和分辨率的许多不同显微技术渐渐得到了发展。 该白皮书说明了选择相机时要考虑的各个方面。

  要在显微镜中使用图像处理,选择最适合显微应用的组件至关重要。除了显微镜本身,还需要选择合适的镜头、光源,以及——取决于是否使用染料和比对方法,还需要滤光片组和偏振镜。最终,相应应用的特殊要求决定了如何选择最适合的显微相机和兼容的图像处理软件。

  数字显微相机以最优的使用图像数据的方式提供显微图像。该图像数据可被记录、存储、打印或嵌入文档;然后使用特殊的软件,在PC 或移动设备上以数字方式处理和分析由显微相机提供的这些图像数据。数字显微相机提供的图像可以快速地显示在大屏幕显示器上,因此方便用于现场演示或观察等目的。

  不过,如何为显微应用寻找合适的数字相机,在做选择时必须考虑哪些方面?

  1. 黑白相机还是彩色相机?

  彩色相机在其应用中是非常灵活的,是传统光学显微镜广泛应用领域中不可分割的一部分。生物医学和临床实验室装置以及工业和材料研究中的许多常规微观应用是基于使用各种光源和比对方法的传统光学显微镜。此外,显微标本通常使用特殊的染色技术,以便详细分析原本对比度较低的结构,例如作为疾病组织病理学诊断的组成部分和监测疾病发展。

  因此,对于显微成像,色彩保真度和色彩重现应该尽可能准确,以便材料和生物样本中最细小的结构区别可以重现。

  显微相机中的数字彩色芯片使用与感光芯片匹配的不同颜色的滤光片记录色彩信息。

  黑白芯片(左)和芯片上带Bayer滤光片形式的彩色滤光片的芯片(右)。 通常,彩色芯片会使用较小但较多的像素来实现同等“真实”的分辨率。 黑色区域代表重现中的一个点。

  通常,彩色芯片的每个像素只记录一种颜色,但通常图像上每个像素都包含所有颜色。为了达到这个目标,每个像素都会使用相邻像素的信息。要给每个芯片像素分配完整的颜色信息,必须对每个三原色以插值填充缺口(“去拜耳化”)。去拜耳化可能导致插值效应,并且彩色滤光片会降低光吸收效率,特别是在光照条件不佳的情况下。

  然而,得益于灵敏度相当高的彩色相机,可以使用较低的光强度实现大量的应用,例如在标准荧光显微镜中。彩色相机可以工作在明场与暗场中,非常适合显微镜,可以在比对程序和荧光应用中选用。它们也适合使用多波段滤光片同步监控和记录一些荧光体。

  肾脏组织的光显微图像:为区分不同的细胞和组织结构,对组织学组织部分使用苏木精和曙红进行了染色(HE染色)。

  黑白相机提供成像芯片上的亮度值的完整信息,虽然没有颜色信息。即使没有进一步的计算,此处每个像素的信息也都是可用的。黑白相机没有彩色相机由于通过彩色滤光片吸收光能而损失强度的问题。然而,黑白芯片通常在芯片前面有一个二维红外截止滤光片,抵消了光源发射的红外光。在许多应用中,发出的这些红外光不会对图像信息作出贡献,只会降低图像的对比度。

  因此,如果不需要颜色信息,可能会提高灵敏度和加强信息内容。因此,黑白相机非常适合应用在复杂的荧光显微镜中。曝光时间可能会减少,因此敏感的荧光样品的应用效果相当好。即使在弱光信号中,对光线更敏感的芯片也可以呈现低噪声图像。特殊的NIR芯片版本增强了包括近红外范围在内的敏感性。

  活的人类黑色素瘤细胞的荧光显微图像:荧光染色后,某些细胞质元素呈现绿色,而细胞核呈现蓝色荧光。

  2. 感光芯片类型(CCD与CMOS)、快门选择、帧速率

  下一个重要步骤是选择最合适的芯片。从技术的角度来看,需要在CMOS与CCD芯片之间作出选择。接下来需要选择最好的帧速率,即:无缝处理任务,相机每秒必须提交的图像数量。

  感光芯片类型

  市场上有大量适合作为显微相机成像芯片的基于CCD(电荷耦合器件)和基于CMOS(互补金属氧化物半导体)的芯片。这些芯片类型的技术设计完全不同,因此它们的特征属性也不同。如何选择正确的芯片类型取决于应用。

  CCD和CMOS芯片将光信号(光子)转换成电信号。值得注意的是它们不同的特征以及这些特征将如何随进一步的技术开发而改变。

  CCD感光芯片有哪些显著特点?一般来说,CCD芯片具有低噪声因子、高填充因子、高信噪比、高颜色保真度的成像特点,可输出超高品质图像。这些属性使得使用CCD芯片的相机成为弱光条件下应用不错的选择。

  今天的CMOS芯片有时比一些普通CCD芯片更优秀。

  近年来,得益于根本性的新发展,它们赶上了CCD芯片。凭借高速(帧速率)、高分辨率(像素数)、低功耗以及新改良的噪声指数、动态范围、量子效率及色彩概念等各方面优势,CMOS芯片逐渐在由CCD芯片统治的领域里取得了一席之地。这一点同样适用于显微镜(特别是高速显微镜),而新色彩概念的现代CMOS芯片能提供优秀的实时成像。

  CMOS面阵感光芯片

  鉴于CMOS技术近年来所取得的长足进步,可以预期其在未来也一定会有更多突破性的新进展。市场趋势表明,最新的CMOS技术将一定程度地取代CCD技术。

  帧速率

  这个专业术语的含义为“每秒多少帧图像”或“fps”。这些术语描述芯片可在每秒钟拍摄与传输的图像数量。

  帧速率越高,芯片的速度则越快,也就是说每秒能够拍摄更多图像,并且传输更高的数据量。可能或必要的帧速率取决于随相机使用的显微系统类型和显微镜中的相机需要记录的内容。

  对于许多系统,直接查看监控上的无延迟实时成像是主要目标,这可以实现对样品的无缝筛查与快速聚焦。人类的大脑每秒能检测约14到16幅画面,而训练有素的人可以显著提高这个数字。标准影院电影的帧速率为24 fps,最近的出品甚至达到48 fps。理想情况下,标准显微相机的帧速率是在这一范围内。

  然而,确定实时监控舒适度的不仅是移动图像的平滑播放,而且还有良好的成像质量和清晰度。这里逐行扫描技术提供了一个决定性的优势。

  对于除了要求高成像质量还要求高吞吐量的自动化应用,显著提高帧速率非常重要——例如,在样品范围的自动扫描中,要求自动聚焦或在尽可能最短的时间内用多张图像重现整个样品。

  快门

  与芯片选择相联系的是快门系统的选择。

  全局快门以及滚动快门是两个主要的快门选项。快门能够保护相机内部的芯片不受入射光线的影响,且只有在曝光时才会打开。所选的快门或曝光时间将会确保像素接收适当数量的光子,并决定快门维持打开状态的时间。CCD芯片只使用全局快门,而CMOS芯片则提供全局快门与滚动快门两种版本型号。

  两个版本快门的差别在于芯片曝光图像的方式:

  全局快门是整个芯片同时曝光,也就是说光线将同时照射到芯片的整个表面。

  而滚动快门是在很短的时间序列中(数微秒内)逐格渐次曝光。取决于所选取的曝光时间以及目标的实际速度,目标在曝光过程中移动可能会导致图像失真。这被称为滚动快门效应。

  显微镜应用中的某些情况(例如在样品/试样台高速运动的情况下或高动态过程的观察中)不希望发生这一效应。然而,带滚动快门的芯片非常适合大多数标准应用,它们提供了一些胜过全局快门的优势。得益于低读出噪声,其动态范围明显更高,给人印象深刻。高动态范围允许实现极高品质的记录以及对详细结构信息的分析。

  此外,通过使用特定范围内的曝光时间,能够防止滚动快门效应。一些用于科学应用的基于CMOS的高性能相机即工作在滚动快门模式下。

  3. 分辨率、感光芯片与像素尺寸

  在数字图像处理中,因数字图像能够以不同大小打印或重现于不同尺寸的显示器上,传统显微镜中作为镜头和目镜放大倍数计算结果的专业术语“放大倍数”失去了其原有的意义。但是,主要由镜头的数值孔径(NA)确定的镜头光学分辨率仍很重要。

  相机拍摄的同一幅图像,以不同像素数显示

  分辨率

  在显微镜中,专业术语“分辨率”指的是两个高对比度对象可以在显微镜下被识别为图像中两个单独的对象而不会被合并为一个对象的最小距离(dmin)。

  对于最佳光源条件下的常规光学显微镜,分辨率是由所用光的波长λ(计算时通常使用550 nm)以及由所用显微镜镜头的数值孔径NA决定的。

  适用Rayleigh准则:dmin = 0.61·λ/NA。

  专业术语“分辨率”也用于描述数字相机的芯片。它经常被用于指示芯片上的像素数量。例如,相机的分辨率可以是800万像素,这意味着光学配件投影到芯片上的成像随后被分解成芯片上的800万个像素。应用这一术语,指定芯片使用100万像素与3200万像素之间的“分辨率”。

  不过,指定像素分辨率更有意义。如果沿相机像素的边长向后经过光学配件跟踪到对象,像素的分辨率显示理想情况下一个相机像素应该涵盖的对象上相应的距离长度。

  对于显微相机,显微镜中所使用的任何镜头的像素分辨率应该高于镜头的光学分辨率。事实上,我们推荐使用像素分辨率至少是光学分辨率三倍的镜头。

  对显微镜镜头来说,数值孔径范围在0.1(通常针对4倍放大的镜头)和1.3(通常针对100倍放大的镜头)之间(对应于3.4 m到0.26 m的光学分辨率),在这个范围内最小的光学解析结构可提供足够数量的像素。

  例如,如果需要更低的放大倍数,则需要一台达到相应高分辨率的相机,以便对显微图像的细节进行最佳记录和重现。此时,超过500万像素的分辨率可能确实有用。但是,对于大的放大倍数,由于光学系统的限制,这样的高分辨率通常无法提供任何额外的图像信息。取决于应用,300万到500万像素通常就足够了。

  像素大小也很重要。如果像素非常小,光学配件可解析的最小结构会受到一定的限制。合理的选择是像素宽度5 m或以上的黑白芯片以及像素边长大于等于2.5 m的彩色芯片。

  感光芯片尺寸和视场(FOV)

  越大就一定越好吗?较大尺寸的芯片的优势是较大的表面可容纳较多的像素,因而提供较高的分辨率。其实大型芯片的真正优势在于单个像素的尺寸仍足以确保能够取得较好的信噪比——较小的芯片所能够使用的空间不多,因此需要使用尺寸较小的像素(另请参阅“像素大小和灵敏度”一节)。

  然而,实际上需要多大的芯片呢?在这里,除了所需的像素大小和像素数目外,能否最优化重现视场起到了重要作用。

  使用显微镜时,通过两个步骤创建图像:显微镜的镜头创建(必要时连同显微镜中的镜筒镜头)中间图像。用户通过目镜查看此中间图像。总放大倍数由镜头的放大倍数和目镜的放大倍数决定。由于物理和技术的限制,镜头只能在有限区域创建具有完整图像清晰度的中间图像。圆形镜头图像的直径(如果适用)则称为镜头的视场宽度。

  镜头的图像由目镜再次放大。区域的最大直径(目镜仍然可以清楚地放大的范围)称为目镜的视场。目镜视场和镜头的视场直径应该相匹配,达到“模拟”显微镜的最佳重现效果。目镜的视场(视场数)表示特定显微镜镜头的视场大小。目镜常用的视场数是18、20 或22mm等等。然而,在实践中超过23或25mm的视场直径也是常见的。

  通过使用匹配的三目镜筒(主要使用C口连接)或目镜固定器使显微相机适合显微镜,可以绕过目镜的光学配件,直接通过相机查看镜头的中间图像。

  因此,镜头的视场直径是显微相机的决定性值,因为通过显微镜镜头创建的图像会被直接复制到显微相机的芯片。因此,显微相机的芯片大小与视场直径应实现最优匹配。一方面要将圆视场的最大部分重现到有棱角的芯片上,另一方面还要防止最接近视场边缘的地方出现重现错误。这意味着,芯片的图像对角线应该比镜头视场直径略小一些,以便芯片图像的所有区域都能以最佳清晰度重现。

  市场上芯片的图像对角线不一而足。上图显示了最常见的芯片大小。以英寸表示芯片大小是因为历史原因确定的,它遵循反映早期的图像记录管的直径的约定。遵循此约定,一英寸不等于25.4mm, 而是大约16mm。

  对于许多标准的显微镜光学配件,大小为2/3"的CCD、CMOS芯片在放大倍数、分辨率和显微镜视场中图像部分的大小之间提供了理想的折中方案。

  如果选择了一个过小或过大的芯片,需要使用集成在中间光学配件中的适配器将镜头视场与芯片匹配(也就是进行相应的缩小或后放大)。

  如何调整感光芯片尺寸和视场

  使用带有集成中间光学配件的C接圈优化和调整芯片尺寸和视场:

  镜头放大倍数10x 目镜放大倍数10x 目镜18的视场数

  芯片尺寸1/2"(内部图像部分)和4/3"(外部图像部分)

  1/2" 芯片传送的可见中间图像的百分比是没有进行适应的图像的约12%(内部图像部分)。此图像部分(中间图像部分)可能相应使用带有集成缩小光学配件(0.65x或本案例的0.5x)的C接圈进行优化。 如果芯片明显大于1"(外部图像部分)并超出视场的边缘,可能会使用带有集成放大光学配件的相应适配器(例如1.2x 或1.6x)调整到该视场。

  最常见且最适合显微应用的是纵横比为4:3的芯片。纵横比为1:1的芯片可以重现镜头的直观可见中间图像的最大部分。也可以使用3:2 或16:9等其他芯片格式,但在像素数相同的情况下,因为它们的图像高度低于4:3芯片,所以重现的视场部分较小。

  HD(高清)或全高清格式(目前已经全面作为电影和电视的标准)尽管现在对于显微镜而言仍然有些争议,但它们完全适合(比如说) 将现场图像投放到大型显示器上以用于讨论。通过将视频技术和数字图像处理技术相结合,可以方便地查看、研究和分析快速变化过程。

  像素大小和灵敏度: 正如前面讨论的那样,像素数或更确切地说是图像芯片分辨率对显微图像的信息内容和质量起着关键的作用。尽可能提高分辨率这一总体趋势显而易见,但是分辨率增加也意味着像素减小。一般来说,较大像素的灵敏度高于较小的像素。最终需要具体为每个应用选择图像噪声、信噪比(SNR)、饱和容量和相关的动态范围的最佳组合。

  图像噪声:各种噪声的影响(例如暗噪声、光子噪声或数字化噪声)可能与信号叠加,从而对数字图像产生负面影响。在高灵敏度芯片中,如果在弱光条件下测量信号非常弱,那么图像噪声就会尤其显著。这里的检出限主要由暗噪声决定,暗噪声是热效应(也就是芯片发热)所引起的。可以通过被动或主动对芯片进行冷却大大减少这种热效应,例如利用气流、水或半导体元素(另请参阅“制冷芯片与非制冷芯片”一节)进行冷却。

  饱和容量:饱和容量(也称为满井容量)描述一个单独的像素能够吸收电子的最大数目。光照射芯片生成电子。

  信噪比:大像素比小像素的饱和容量更高。这意味着它们对光在像素中产生的电子有更大的容量。反过来,这意味着它们能够处理更多的光。

  高饱和容量意味着信噪比更好,也就是说像素面越大,信噪比(SNR) 越好。信噪比表示相机数据属于实际图像内容的部分与不需要的噪声信号的差值因子。信噪比SNR越高,成像质量越好。

  简而言之:如果给定芯片大小,相机芯片的像素越多越不利于信噪比(也就是说信噪比较小)。

  动态范围:定义了芯片对光的响应的下限和上限之后,我们最后可以解释漏掉的这个专业术语“动态范围”(DR):它定义为饱和容量(满井容量)与检出限的比率。用另一种方式说明:动态范围是像素作为对入射光的真实响应而能够检测到的最亮值和最暗值的比例。如果您的应用需要高动态范围,则推荐使用像素相对较大的芯片。

  如今,大小在3.5u m和6 um之间的像素提供了以前10 m像素所能提供的输出:在感光度和高分辨率之间实现了良好平衡。像素大小从2.2 um到不到1.4u m的芯片具有高分辨率且价格实惠。它们能提供高分辨率,但因为面积小,所以感光度较低。

  对于荧光显微镜等弱光条件应用,芯片的灵敏度尤其重要。在这种不利的光源条件下,相机需要有好的信噪比,以确保仍能检测到非常低的光信号,同时又有良好的成像质量。

  4. 显微镜应用中制冷CCD/CMOS感光芯片与非制冷CCD/CMOS感光芯片

  所有芯片都会生成所谓暗噪声或暗电流。热会在感光芯片上的像素中生成电子,与光所生成的电子相混合,从而产生干扰,覆盖所需的图像信息,并扭曲图像内容。此外,非制冷芯片的暗电流和噪声会有变化,具体取决于芯片的温度。因芯片在操作过程中会逐渐升温,这会导致与环境和操作温度相关的波动。在长期暴露的情况下,芯片的电压和温度也会升高,它反过来会被解释为像素和感知为噪声。

  通过制冷芯片可以减少暗电流。假设图像信号保持不变,将芯片的温度与环境温度相比降低7摄氏度,暗电流约降低一半。

  在这里新的芯片技术具有明显的优势,这包括新一代的CMOS芯片。得益于较低的功耗和优化的电子元件,这些芯片可显著改进噪声性能。

  带非制冷芯片的数字相机完全适用于许多标准显微镜应用,可提供出色的成像质量,并满足所有的图像处理和分析要求。

  但特别是,如果需要在不利光源条件下长时间曝光,或者需要特别恒定、重现性好的结果进行图像分析或作进一步处理,制冷芯片是正确选择。例如,在现代荧光显微镜中的复杂应用、在活的有机体内的生物发光应用或在天文学中,这种要求占主流。

  5. 接口

  一般来说,相机用户通常可以在几个接口之间加以选择。最重要的适用接口是USB 2.0、USB 3.0、1394 (FireWire)、千兆网(GigE)或Camera Link。

  作为众多应用的新的简单标准,USB 3.0越来越突出。USB 3.0也被称为Super Speed USB,是流行的新一代“即插即用”通用串行总线规范,它以USB 2.0的优势为基础,同时也纠正了其弱点。目前USB 3.0已经成为无需额外硬件的标准PC接口。在不久的将来,USB 3.0将取代可用接口范围中的1394 (FireWire)和2.0。某些操作系统已不再将1394 (FireWire)作为标准支持。然而,将来仍然能够在任何商用PC上运行USB 3.0相机,而无需附加接口硬件。

  这一快速接口是实时兼容的。此外,USB 3.0接口的技术实现可将图像数据直接传输到主存储器,从而节省处理器资源;释放出的处理器产能可用于图像处理应用。这反过来可实现更复杂的处理步骤,并将结果更快地演示给用户。

  如果需要长线材,就是更具优势的千兆网(GigE)接口的舞台。

  6. 总结

  要为您的特定应用选择显微相机,可入选的产品范围很广。这一范围包括了使用不同的感光芯片技术、芯片尺寸、分辨率和帧速率的彩色和黑白相机型号。

  未来,得益于性能的进一步发展和显著改善,带CMOS芯片的相机将在显微镜应用中发挥重要作用。CMOS芯片不仅具有成本效益、尺寸紧凑、用途广泛,同时还提供半导体芯片不会发生光晕或拖影效应的优势。此外,较新的CMOS芯片可降低噪声。预计CMOS芯片将在数字相机中的许多应用领域取代CCD芯片。

  在选择最合适的显微相机时,可能需要考虑以下几个重要方面:

  成像真实生动,实现样本的平滑移动和方便聚焦

  最大限度地提高成像质量和颜色保真度,提供良好的对比度范围,以进行记录、图像处理和分析

  为光线水平弱的应用提供极好的灵敏度

  应用特点决定了潜在的具体芯片类型,例如:CCD、CMOS、NIR(近红外)优化版本

  视场最佳重现所需的像素尺寸和分辨率影响所需的芯片尺寸

  取决于原来的系统和意向的通用性,还要考虑大小,重量,用户舒适度,对DirectShow、TWAIN、USB3 Vision、GenICam等软件标准的遵从

  相机选择贴士:

  更多相机选择,请登录核成科技公司网站。

  彩色相机可普遍使用。如果希望使用彩色相机,请确保相机提供颜色配置。

  对于复杂的荧光应用,请考虑产生噪声较少的黑白相机。

  如果希望在低放大倍数下重现样品的大部分,例如要将图像用于记录和存档目的,请选择高分辨率。

  选择合适的相机显微镜适配器,以便实现对视场的最佳利用。

  如果您的主要目标是在屏幕上查看样本,那么实时图像的成像质量和相机的速度就尤为重要。

  对于标准的显微镜应用,低帧速率的CCD相机一般足够了。

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